干旱区生态环境知识资源中心(Arid): 加工番茄主要病害病原鉴定及综合防治技术研究与示范

Arid

	加工番茄主要病害病原鉴定及综合防治技术研究与示范
	向本春; 赵思峰; 黄家风; 郑银英; 都业娟; 崔百明; 吴彩兰; 杜娟; 李明; 赖军臣; 熊建喜; 杨晓红; 徐公社; 翁晓梅; 唐晓红
完成单位	石河子大学农学院
登记(发布)日期	2011
中文摘要	新疆是我国最重要的加工番茄种植和加工基地,每年种植面积在100万亩左右,然而,加工番茄在生长发育过程中会受到各种病原物、昆虫、螨类以及寄生性种子植物和其它杂草的危害,这些有害生物都会对加工番茄的产量和品质造成严重影响,为防治这些有害生物很多时候需要采用化学防治手段,但不合理的使用农药、激素和化肥会对加工番茄的生长造成危害,同时,还会造成加工番茄中有害物质的超标,最终影响加工番茄产品的出口和贸易。加工番茄侵染性病害的种类约有30多种,有些病害在加工番茄上普遍发生,如苗期猝倒病、立枯病;有些在生产上严重发生,如病毒病和生长中后期的根腐病等,目前已成为加工番茄生产上的严重问题。近年来,随着西部地区降雨量的增加,细菌性斑点病、疮痂病以及早疫病、叶霉病等病害有日益严重的趋势,在个别年份会造成严重的损失。植物病毒主要由生物介体携带,从生物介体创造的伤口中侵入寄主,在加工番茄植株间不断扩展和蔓延,通过干扰寄主的遗传物质的复制以及生理生化活动,最终导致病毒病的严重发生,从而严重影响加工番茄的产量和品质。通过加强对加工番茄病毒病种类的识别,毒源的鉴定,明确病毒病的种类,同时通过加强病毒的快速检测技术,做到病毒病的提前识别,通过抗病毒品种的鉴别、筛选和培育,以及安全控制传毒介体和采用调整播期等技术和方法,可以有效控制病毒病的发生。加工番茄真菌病害,如早疫病、根腐病病菌可以直接侵入寄主,通过毒素或者酶破坏寄主,最终导致加工番茄严重的损失。对这类病害可以通过抗病品种鉴别、农业防治、化学防治以及生物防治综合运用的方法开展有效防治。将不同种类的防治措施综合配套施用,从而达到有效控制各种加工番茄主要病害的作用,是本课题努力地方向和目标。项目经过7年的试验研究,超额完成了各项研究任务指标,实现了预期的研究目标,现对照课题设置的主要性能指标,将任务指标完成情况简要总结如下：按照课题研究任务的要求,基本明确侵染新疆加工番茄的病毒病的主要类群及其发生规律,并依据新疆病毒病的主要类群,开展防治技术研究和抗病毒育种工作;基本明确新疆加工番茄上的植原体的主要种类及危害特点;基本明确引起新疆加工番茄大面积死苗的苗期烂根病和生长中后期的根腐病的主要病原种类及发生特点,并开展生防菌的的筛选及生物农药的研制、开发和试验示范,为根腐病的防治提供产品和技术;基本明确严重危害加工番茄叶片、茎秆和果实的早疫病的发生规律等方面的研究;在课题组全体研究人员的共同努力下,圆满完成了课题的计划任务,取得的成果主要体现在下列方面： 1.从分子水平上明确危害新疆加工番茄的病毒种类有：番茄花叶病毒(ToMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、蚕豆萎蔫病毒(BBWV)、中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)、烟草花叶病毒(TMV)、马铃薯Y病毒(PVY)和马铃薯M病毒(PVM)。 2.对侵染新疆加工番茄的主要病毒番茄花叶病毒(ToMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、蚕豆萎蔫病毒(BBWV2)及新发生的中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)进行了全基因组测序,为进一步进行抗病毒转基因育种选择目的基因奠定基础,也为建立荒漠绿洲区植物病毒基因资源库,及利用和开发新疆微生物基因资源奠定了基础。 3.首次明确新疆加工番茄受到粉虱传双生病毒的侵染。中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)由近年传入新疆的一类危险性入侵生物B型烟粉虱传播,被称为粉虱传双生病毒。该类病毒在许多国家引起番茄毁灭性危害,已在全球范围内猖獗危害,正在成为农业上的严重威胁,该病毒在新疆加工番茄上的发现需要引起高度重视。 4.建立了加工番茄不同病毒种类单个及复合侵染的快速检测技术 (1)分别用番茄花叶病毒(ToMV)的特异性引物和烟草花叶病毒(TMV)的特异性引物建立了RT-PCR检测体系,可以快速有效地区分田间TMV感染、ToMV感染以及复合侵染的自然感病的病株。 (2)利用蚕豆病毒属(Fabavirus)的兼并引物,通过RT-PCR检测方法能够很好地用于感病植物BBWV的带毒检测,同时明确,新疆加工番茄自然感染的均为BBWV2,没有发现BBWV1。 (3)利用粉虱传双生病毒的兼并引物,通过PCR检测体系可以快速有效地检测田间自然感染双生病毒的病株。 (4)用针对ToMV、BBWV2和CMV的单克隆抗体通过酶联免疫吸附试验(ELISA),可以快速有效地对田间自然发病的病株进行了带毒量、带毒率及复合侵染的检测。 (5)利用用马铃薯Y(PVY)的特异性引物建立了RT-PCR检测体系,可以快速有效地区分检测PVY。 (6)利用用马铃薯M(PVM)的特异性引物建立了RT-PCR检测体系,可以快速有效地区分检测PVM。 5.利用RT-PCR检测技术及病毒单克隆抗体的ELISA检测方法,对田间自然发病的病株进行带毒检测。结果表明,ToMV、CMV和BBWV是危害新疆加工番茄的主要病毒,其复合侵染是造成田间坏死条斑症状的主要因素,并且ToMV、CMV和BBWV在病株上的带毒量互为正相关关系。 6.用针对ToMV、BBWV和CMV的单克隆抗体通过ELISA检测,对田间自然发病的不同品种进行了抗病性鉴定,虽然供试品种均不抗病,但品种之间却表现出一定的抗病性差异,主栽品种里格87-5为中感品种;石番8和石番27是ToMV、BBWV和CMV的耐病品种;里格87-6、石番20B、美国世纪红和石番98-1是ToMV的耐病品种;石番9和石番4是ToMV和BBWV的耐病品种。 7.进行品种抗病性鉴定时,用病情指数虽然可以反映品种的抗病程度,但是无法反映品种的实际带毒量及多种病毒复合侵染时各病毒间的相互关系,也无法反映病毒隐症危害的情况。本研究提出带毒指数的概念,并将其运用于品种抗病性鉴定。用血清学检测的数据量化病株的带毒量,划分带毒级别,用带毒指数反映品种实际的带毒情况,弥补了单纯用病情指数反映抗病性的不足,避免了人为调查病级造成的误差或病毒由于隐症侵染或症状潜伏造成的误差。 8.通过对不同品种、不同播期加工番茄病毒病害发病情况的调查发现晚播加工番茄坏死条斑型病害发病重,不同品种适宜的播期不同。 9.在GenBank上登录9条植物病毒基因组全序列。 10.明确了采用滴灌措施以后,新疆加工番茄叶部病害如(早疫病、叶霉病)以及叶部和果实的细菌性病害(疮痂病和细菌性斑点病)都有一定程度的减轻,但加工番茄土传病害发生有明显加重的趋势。 11.从新疆各加工番茄主产区采集根腐病样品162个,从中分离获得了病原物120个分离物,其中腐霉菌93个,占总分离物的77.5%,镰刀菌15个,占总分离物的12.5%,丝核菌3个,占总分离物的2.5%。明确了新疆加工番茄上发生的土传病害种类主要有苗期的烂根病和生长中后期的根腐病,其病原菌主要为腐霉属真菌,其次为镰刀菌和丝核菌。对占主要类群的腐霉病菌进行了形态学和分子鉴定,初步将其鉴定为3个种,即瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum (Edson)Fitzp,56株,占腐霉分离物的60.22%)、简囊腐霉(Pythium monospermum Pringsheim,6株,占腐霉分离物的6.45%)和棘腐霉(Pythium acanthicum Drechsler,2株,占腐霉分离物的2.15%)。由于腐霉菌和丝核菌会直接导致加工番茄幼苗死亡和生长中后期植株的死亡,因此确定以瓜果腐霉菌和立枯丝核菌作为本课题生物农药防治的主要针对对象。 12.明确了过氧化氢酶、脲酶、蔗糖酶、磷酸酶和蛋白酶与植物的根部健康状况呈正相关,说明健康植株根际土壤的相关酶活高,与之相关的微生物类群更多,活性更高,因此植株生长更加健康,抵抗病害的能力增强。但在所有过程中,健康植株的纤维素酶活性均低于同时期的发病和死亡植株的,死亡植株根际土壤中纤维素酶活性最高,其次为发病植株,最低的为健康植株的。可能与病原菌导致植株根腐病后植株根部腐烂,植物组织中纤维素分解有密切关系。 13.明确了不同发病程度加工番茄根际土壤中细菌、真菌和放线菌数量变化情况。在加工番茄的不同生育阶段,三大种类微生物的数量随着植株生长,数量不断增加,到果实膨大期数量最多,在果实成熟期开始减少,但在所有的生育期都表现为健康加工番茄根际细菌数量最多,其次为发病植株的,死亡植株根际细菌数量最少,且健康植株根际细菌数量与发病和死亡植株的相比差异显著。在两块地中加工番茄的不同生育时期,真菌的数量则与细菌分布状况相反,死亡植株根际细菌数量最多,其次为发病的,而健康植株根际真菌数量最少。相对而言,健康植株和发病植株根际放线菌的数量要高于死亡植株根际的数量,这与前人的很多报道是一致的。 14.土壤中脂肪酸分析结果表明健康加工番茄根际的微生物种类多于发病和死亡植株根际土壤的微生物种类,而且微生物的种群结构分布较为均匀,有助于维持植物根际微生物种群结构的稳定,保持植物健康生长。加工番茄根腐病不同发病程度与根际土壤微生物基因多样性的DGGE分子指纹图谱相关关系分析结果表明,相对于发病的和死亡加工番茄植株来说,健康植株根际土壤中微生物指纹图谱条带数目更多,多样性指数更高,丰度也最高,说明健康植株根际细菌数目更多,同时组成结构也更加复杂。 15.筛选获得了能够有效抑制立枯丝核菌生长并能有效防治加工番茄苗期烂根病的生防菌菌株5个,即S23、S37、S44、S71和S228,以及一个生防菌组合S44。将S37、S44和S44发酵液通过拌种和滴灌施用到加工番茄根部后进行小区和大田田间试验,对加工番茄苗期烂根病的防治效果可达60%以上,而且具有明显的促进生长的作用,防病效果好于五律硝基苯、敌克松和福多甲等化学农药和种衣剂。筛选获得了能够有效抑制瓜果腐霉病菌生长并能有效防治加工番茄中后期根腐病的生防菌菌株3个,即S23、S37、S44,同时,将S37和S44发酵液通过拌种和滴灌施用到加工番茄根部后进行小区和大田田间试验,对加工蕃茄根腐病的防病效果达到65%以上,防病效果与防治卵菌纲真菌效果很好的甲霜灵相当。对上述生防菌的抑菌谱检测结果表明,这些生防菌还能够有效抑制枯萎病菌、菌核病菌、疫霉病菌、番茄早疫病菌和番茄细菌性斑点病菌。 16.对生防菌的高效低成本的发酵培养基配方进行了筛选,最后获得的最终发酵培养基配方为(g/L)蜂蜜5、玉米粉10、酵母浸膏5、豆粕10、碳酸钠2、磷酸氢二钾2.硫酸镁0.2、碳酸钙1、硫酸锰0.1、氯化铁0.1、氯化钠0.5。通过发酵培养基的优化,使得发酵菌量比原始培养基的发酵菌量提高了将近5倍。获得了生防菌(S37、S44以及S44)的发酵工艺,即：最适发酵培养基初始pH为7.0、最佳收获期为发酵培养48h、混菌发酵时,最佳接种比例为2:1:2、最佳温度为30℃。获得了生防菌(S37、S44以及S44)的生产工艺,即种子培养基繁殖菌种的时候,最佳接种量为5%,此时发酵时间最短,成本最低;产品大规模生产过程中,发酵罐中装液量与发酵罐体积之比达到1:2时,即发酵罐装液量达到发酵罐体积的2/3,发酵产物得率最高;发酵转速为200r/min时,发酵生物量以及抑菌效价达到最高;在发酵培养基中添加天冬氨酸后能够显著促进生防菌量的增加,通过发酵工艺的优化,使得发酵量提高10倍以上。建立了生物农药的考察标准。由于细菌计数相对比较麻烦,建立了采用抑菌效价检测生物农药的快速检测方法。 17.对生防菌防病机理进行了研究,对生防菌的代谢产物进行了初步研究,其能够通过硫酸铵沉淀,能与茚三酮发生颜色反应,在30～120℃范围内,温度对其抑菌活性影响不大,pH5.0～9.0的范围内,抑菌活性较高,能够耐受紫外线的照射,初步确定其抑菌物质为一种小分子的蛋白质。采用DEAE-sepharose离子交换层析对抑菌蛋白的纯化条件进行了初步研究,确定在纯化过程中,pH6.8的磷酸缓冲液为抑菌蛋白的的平衡缓冲液,并获得了单一抑菌蛋白的离子交换色谱纯化条件,为进一步开发抗菌肽奠定了基础。对生防菌的促生和诱导抗病机制进行了研究,用生防菌处理番茄种子后,能够降低种子的电导率,同时能够提高种子蛋白酶活性,提高种子的活性,诱导加工番茄与抗病性有关的酶,如过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的增加,提高植株的系统抗病性。用生防菌发酵液以及生防菌抑菌蛋白处理病原菌后,能够降低病原菌的呼吸强度,造成病原菌细胞内物质外渗,电导率提高,最后使病原菌菌丝崩解。 18.本研究通过PCR技术克隆了枯草芽孢杆菌S44菌株ituD基因,序列分析表明,该序列全长为1203bp,编码400个氨基酸,与已报道的ituD氨基酸序列同源性为85%。同时构建了原核生物表达载体pET28a(+)-ituD,对不同的IPTG诱导浓度和诱导时间等条件的优化结果表明,37℃8h能诱导ituD融合蛋白的最大量表达,在0.5mmol/L IPTG浓度下可以成功表达出ituD蛋白。为进一步构建该基因的缺失突变株来深入研究该基因的结构、功能及其与iturinA的合成量奠定基础。 19.通过甲醇抽提法获得脂肽粗提物,用平皿对峙法分别检测枯草芽孢杆菌S44的iturins粗提物对番茄早疫病菌、大豆立枯丝核菌、棉花黄萎病菌、西瓜枯萎病菌及瓜果腐霉病菌5种供试病原真菌的抑菌活性。测定结果表明,该粗提物对番茄早疫病菌的抑菌效果最好,对西瓜枯萎病菌、大豆立枯病菌及棉花黄萎病菌次之。 20.通过对粗提物的理化性质的测定,明确了脂肽粗提物的稳定性。将枯草芽孢杆菌S44的iturins粗提物在紫外灯下照射1h、2h和4h及在自然光下照射3h、6h和12h;60℃、80℃、100℃(电热恒温水槽内进行)、121℃(高压锅内进行)条件下处理30min,待自然冷却后各取出1ml;将粗体物分装6份,分别用0.5MHCL或NaOH调PH范围为1～13,然后将每份样品过滤,分别以未经过热处理的粗提物为对照,用平皿对峙法检测各处理对番茄早疫菌的抑菌活性,结果显示该粗提物在紫外光、自然光下具有很好的稳定性,也具有很好的热稳定性和酸碱稳定性,为该粗提物的应用奠定基础。 21.iturins粗提物的作用机制研究表明,粗提物同时具有抑菌和杀菌功能。用二倍稀释法检测该粗提物对番茄早疫菌的抑菌活性,通过平皿对峙法测定结果表明,随着稀释倍数的增大,粗提物抑菌活性逐渐降低,稀释64倍后,粗提物抑菌效果不明显。用粗提物处理的番茄早疫菌菌丝形态变化显著,菌丝断裂、顶端膨大、肿胀畸形;细胞膜破裂、原生质释放;粗提物对孢子具有强烈的抑制作用,孢子变畸形,抑制孢子的萌发。 22.明确了不同培养基中脂肽粗提物的产量变化及获得脂肽粗提物最大产量的枯草芽孢杆菌S44发酵的优化条件。分别选取PD、PS、YPG、Landy四种不同培养基,按照相同方法提取脂肽抗生素,通过平皿对峙法分别检测粗提物对番茄早疫病菌、大豆立枯丝核菌、棉花黄萎病菌、西瓜枯萎病菌4种供试病原真菌的抑菌圈大小,初步确定枯草芽孢杆菌S44在不同培养基中所产脂肽粗提物的含量。测定结果表明,PD、YPG培养基中脂肽粗提物产量较高,故选取PD、YPG培养基进行脂肽粗提物的制备,通过响应面方法来确定获得脂肽粗提物最大产量的培养方式。结果显示,PD、Landy两种培养基的最佳培养时间分别为64.8h和60.49h;接种量分别为：3.2%和3.08%。 23.建立了新疆加工番茄主要病害综合防治技术体系,从2005年开始,累计在农六师103团和新湖农场,农八师143团、147团和石河子总场试验示范103万亩,为农六师和农八师培训技术人员1200人次,创造经济效益12049.8万元。 24.成功申报"973"计划前期《利用RNAi技术培育抗病毒加工番茄优质材料的研究》(项目编号：2008CB117018)、国际科技合作与交流专项《新疆加工番茄主要病毒病毒病的分子解析和抗病毒育种》(项目编号：20072072)各1项。 25.截止2011年12月,课题组共发表有关研究论文29篇,出版专著1部;申请国家发明专利2项。
中文关键词	加工番茄 ; 主要病害 ; 防治
成果类型	应用技术
中图法分类号	S436.412
URL	http://dbpub.cnki.net/grid2008/dbpub/detail.aspx?dbcode=SNAD&dbname=SNAD&filename=SNAD000001512482
资源类型	成果
条目标识符	http://119.78.100.177/qdio/handle/2XILL650/242900
推荐引用方式 GB/T 7714	向本春,赵思峰,黄家风,等. 加工番茄主要病害病原鉴定及综合防治技术研究与示范[Z]. 应用技术,2011.